Культура клеток

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор^[1], содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней^[2]. Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. В 1910 г. Пейтон Раус, работая с культурой клеток саркомы цыплёнка, индуцировал образование опухолей у здоровых животных. Позже это привело к открытию онкогенных вирусов (Нобелевская премия по физиологии или медицине 1966 г.).

Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведённых с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa.

1885 — Ру (Roux) продемонстрировал возможность поддержания клетками куриного эмбриона жизнеспособности вне тела животного в солевом растворе^[3].

1907 — Гаррисон (Harrison) культивировал спинной мозг амфибий в сгустке плазмы. Он пытался показать, что аксоны образуются в виде выростов отдельных нервных клеток^[3].

1910 — Раус (Raus) с применением фильтрованного экстракта куриной опухоли индуцировал опухоль. Позднее было показано, что в основе такого эффекта лежал РНКовый вирус саркомы Рауса^[3].

1913 — Каррель (Carrel) доказал, что в асептических условиях клетки могут расти в культуре в течение длительного времени, если их обеспечить необходимыми питательными веществами^[3].

1948 — Эрл (Earle) и сотрудники установили, что одиночные клетки линии L в культуре формируют клоны клеток^[3].

1952 — Джей (Gey) и сотрудники получили перевиваемую клеточную линию из карциномы шейки матки; эта клеточная линия широко известна как HeLa^[3].

1954 — Леви-Монтальчини (Levy-Montalchini) и сотрудники показали, что в культуре ткани фактор, стимулирующий рост нервов, вызывает рост аксонов^[3].

1955 — Игл (Eagle) - впервые систематически исследовал пищевые потребности клеток в условиях культуры ткани и обнаружил, что клетки животных способны существовать в определенной смеси низкомолекулярных веществ, дополненной некоторым количеством белков сыворотки^[3].

1956 — Пак (Puck) и сотрудники отобрали мутантные клетки HeLa, потребности которых для роста в культуре существенно отличались от потребностей других клеток^[3].

1958 — Темин и Рубин (Temin, Roubin) количественно описали инфицирование клеток цыпленка в культуре очищенным вирусом саркомы Рауса. В течение следующего десятилетия Стокер, Дульбекко, Грин (Stocker, Dulbecco, Green) и другие вирусологи установили основные характеристики вирусной трансформации различных типов^[3].

1961 — Хайфлик и Мурхед (Hayflick, Moorhend) показали, что в культуре фибробласты человека погибают после определенного числа делений^[3].

1964 — Литлфилд (Littlefield) впервые использовал для выращивания гибридов соматических клеток селективную среду HAT. Это нововведение в сочетании с методом гибридизации клеток позволило приступить к изучению генетики соматических клеток^[3].

1964 — Като и Такеуши (Kato, Takeuchi) получили целое растение моркови из растущей в культуре тканей клетки корня^[3].

1965 — Хэм (Ham) предложил бессывороточную среду определенного химического состава, которая способна поддерживать рост клонов некоторых клеток животных^[3].

1965 — Харрис и Уоткинс (Harris, Watkins) индуцировали вирусом слияние клеток мыши и человека и получили первые гетерокарионы клеток млекопитающих^[3].

1968 — Августи-Точчо и Сато (Augusti-Tocco, Sato) адаптировали к условиям культуры клеток опухолевые клетки мыши (нейробластомы) и выделили клоны, которые реагировали на раздражение электрическим током и разрастались в нервные волокна. Одновременно получено большое количество других дифференцированных клеточных линий, включая линии скелетных мышц и печени^[3].

1975 — Келер и Мильштейн (Kehler, Milstein) получили первые клеточные линии гибридом, секретирующих моноклональные антитела^[3].

1976 — Сато (Sato) и сотрудники опубликовали первую серию статей, в которых было показано, что для роста в бессывороточной среде разным клеточным линиям необходимы различные смеси гормонов и факторов роста^[3].

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов, как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс^[4]. Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными^[5]. Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений такие клетки стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации, но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы^[6][7].

Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур^[8][9]. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др^[10]. Факторы роста, используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста^[11].

Клетки можно выращивать в суспензии, либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно изменённых таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности; это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения адгезивных свойств, а также для стимулирования роста и дифференцировки. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяются органотипические культуры клеток, которые представляют собой трёхмерную среду, в отличие от обычной лабораторной посуды. Эта система культивирования физически и биохимически наиболее сходна с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии). С целью обеспечения необходимых физических условий для культивирования адгезивных культур и заселения объёма внеклеточного матрикса тканеинженерных конструкций используются системы динамического культивирования^[12] на основе роторных и вихревых биореакторов, биореакторов с непосредственным на скаффолд: компрессионных биореакторов, биореакторов с механическим натяжением и гидростатическим давлением, специальных биореакторов для электростимуляции клеток и тканей, а также комбинированных биореакторов^[13].

При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

• Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
• Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
• Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
• По той же причине может начаться клеточное дифференцирование.

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).

Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH.

Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.

Пассирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма.Суспензивные культуры пассировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует отделить от субстрата и разделить их скопления. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТА или другие ферментные смеси, иногда достаточно только ЭДТА в физиологическом растворе (раствор Версена). Если культура растет медленно, её обычно подкармливают без переноса в другой сосуд, периодически (обычно раз в 2-3 дня) отбирая часть использованной среды и добавляя свежую.

В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путём трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов. Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК.

ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов. Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла^[14]. Этот метод называется трансдукция.

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики, поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета», согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удалённых с их согласия^[15].

Гибридома — это линия клеток, полученная в результате слияния нормальных лимфоцитов с «бессмертными» раковыми клетками. Используется для получения моноклональных антител. Лейкоциты, выделенные из селезёнки или крови иммунизированных животных, производят антитела с необходимой специфичностью, но как у любой первичной культуры, их способность к пролиферации ограничена пределом Хейфлика. Для иммортализации их искусственно сливают с «бессмертной» линией клеток миеломы, в результате чего происходит рекомбинация признаков. После этого линию клонируют и отбирают клоны, способные одновременно к неограниченной пролиферации и производящие антитела против избранного антигена.

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии.

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты, синтетические гормоны, моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин. Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений.

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo.

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки. Вследствие угрозы пандемии гриппа, вызываемого штаммом вируса H5N1, в настоящий момент правительство Соединённых Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определённого баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов.

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара. Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Культуры вирусов выращивают на культурах клеток млекопитающих, растений, грибов или бактерий, в зависимости от природного хозяина конкретного типа вирусов. Но при некоторых условиях могут быть выращены и в клетках другого типа.

В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.

Приведённый здесь список наиболее распространённых клеточных линий не является полным и исчерпывающим.

• Биологическое бессмертие
• Культура тканей
• Выращивание органов
• Биотехнология
• Индуцированные стволовые клетки
• Ниша стволовой клетки
• Питательная среда для эмбрионов
• Культура клеток и тканей

• http://www.liv.ac.uk/~sd21/tisscult/what.htm