שחבור חליפי

במשך שנים רבות שלטה ההיפותזה כי ככל שאורגניזם מורכב יותר ("גבוה" יותר אבולוציונית) מספר הגנים בגנום שלו גדול יותר. מורכבות הגנום האנושי ביחס לאורגניזמים אחרים העלתה השערה, כי הגנום האנושי מכיל יותר מ-100,000 גנים. השערה זו הופרכה לאחר ריצוף הגנום, אז התגלה כי ישנם כ-32,000 גנים מקודדים לחלבון בלבד^[2][3]. כיום מספר הגנים המקודדים לחלבון מוערך בכ-20,000. בהוספת הגנים שאינם מקודדים לחלבון סך הגנים המוערך הוא כ-47,000^[4]. ממצא זה אינו מתיישב עם הידע על כמות החלבונים ורצפי ה-RNA הלא מקודדים בגוף האדם וכן את ההיפותזה ששלטה בעבר "גן אחד חלבון אחד"^[5][6]. הפער מצביע על כך שמספר הרצפים שמתבטאים בגנום האנושי מושפע רבות משחבור חליפי^[1].

ב-1977 התגלה בנגיפי האדנו שגנים מורכבים מאקסונים ואינטרונים^[7]. גילוי זה הוביל את וולטר גילברט ושותפיו למחשבה, שאקסונים יכולים להתחבר בצירופים שונים בתהליך השחבור, ובכך ליצור מולקולות mRNA שונות של אותו גן^[8]. בראשית שנות ה-80 הוערך כי כ-5% מהגנים של אורגניזמים בעלי גרעין מסדר אבולוציוני גבוה (higher eukaryotes), עוברים שחבור חליפי^[9]. כיום ישנו תיעוד של תוצרי שחבור חליפי ב-40%–60% מהגנים בגנום האנושי^[1], ומוערך כי יותר מ-74% מהגנים הם בעלי תוצרי שחבור חליפי^[10]. תופעה זו מתרחשת באורגניזמים רבים, ממערכות ומחלקות שונות כגון: צמחים, תולעים, חרקים, דגים, מכרסמים ופרימטים^{[11][12][13][14][15][16]}.

ישנם חמישה סוגים עיקריים של אירועי שחבור חליפי^[17][18][19]. אירועי שחבור יכולים להתרחש פעם אחת או יותר בלוקוס (אתר כרומוזומלי מסוים)(אנ'). אירועים מורכבים של שחבור חליפי בלוקוס כוללים יותר מסוג אחד של תוצרי שחבור חליפי.

• דילוג על אקסון (Exon skipping - ES) - אקסון אחד אינו עובר שחבור למולקולת הmRNA.
• אתר שחבור חליפי '5 (Alternative splice site 5’ - ASS5) - ישנם שני אתרי שחבור שונים לאותו אקסון בקצה ה'5 של מולקולת ה-RNA.
• אתר שחבור חליפי '3 (Alternative splice site 3’ – ASS3) - ישנם שני אתרי שחבור שונים לאותו אקסון בקצה ה'3 של מולקולת ה-RNA.
• אקסונים שאינם משוחברים בו זמנית (Mutually exclusive exons - MXE) - אקסונים שונים משוחברים בטרנסקריפטים שונים.
• שימור אינטרון (Intron retention - IR) - אינטרון משוחבר במסגרת מולקולת הmRNA הבשלה

בנוסף ישנם שני אירועי שחבור המתרחשים בקצוות הרצף ומנגנון השחבור החליפי שלהם שונה:

• אקסון ראשון חליפי (Alternative promoters/ Alternative first exons - AFE) - שוני באקסון הקיצוני ביותר בקצה '5.
• אקסון אחרון חליפי (Alternative Polyadenylation/ Alterative last exons - ALE) - שוני באקסון הקיצוני ביותר בקצה '3.

רצפים לא מקודדים מתועתקים (long non-coding RNA, micro RNAs) משתתפים בתהליכים רבים, כגון עריכת רצפי DNA ו-RNA, מסלולי איתות תאיים ובקרת ביטוי גנים. ככל הנראה, הם אחראיים למרבית השוני הפנוטיפי בין מינים ופרטים^[20]. בניגוד לרצפים מקודדים, כמעט כל אקסון שאינו מקודד לחלבון עובר שחבור חליפי, ונוצרים טרנסקריפטים רבים לכל מולקולת pre‑mRNA. במחקר שנעשה בבני אדם ועכברים נמצא שחלק מהאקסונים הלא מקודדים שעוברים שחבור חליפי זהים בין האורגניזמים. ממצא זה מצביע על כך שהבקרה על מנגנון השחבור של רצפים אלו שמור אבולוציונית^[21]. דוגמה ל-RNA לא מקודד ידוע הוא XIST (אנ') שמשתתף בהשתקת מקטעים על כרומוזום X הלא פעיל בתאי נקבה ביונקים. לגן זה יש לפחות שני טרנסקריפטים ידועים בבני אדם. ייתכן שההבדל בין הטרנסקריפטים משפיע על הליך ההשתקה^[22].

בעבר גרסו כי שחבור חליפי מתרחש לרוב באזורים לא מתורגמים שנמצאים לפני הרצף המתורגם (5UTR). ממצאים ראשוניים הובילו לדעה שלשחבור חליפי אין השפעה על הרצף המתורגם, ועל כן גם על הפונקציה של החלבון שמתורגם ממנו^[23]. כיום, מחקרים מצביעים על כך ש-70–88% מהשחבור החליפי המתרחש בגנים מקודדי חלבון בגנום האנושי גורם לשינוי בתוצר החלבוני^[24][3][1]. השוני לרוב מתבטא בהחלפה של חומצה אמינית (אחת או יותר) בחלבון, ונגרם על ידי מוטציות בהן מוחדר מקטע (insertion) או ישנו חסר של מקטע (deletion) שאינן משנות את מסגרת הקריאה אך גורמות לשוני ביחידות הפונקציונליות של החלבון^[1]. רק כ-19% מהתוצר החלבוני של שחבור חליפי נגרם כתוצאה משינוי במסגרת הקריאה^[1]. בנוסף, שחבור חליפי יכול לשמש כ"מתג הפעלה" (on-off switch) לביטוי גן כאשר קודון הסיום (stop codon) מופיע מוקדם ביחס לתוצרי שחבור אחרים^[25].

מחקר שנעשה ב-50 גנים בהם תואר שחבור חליפי שנבחרו בצורה אקראית, הראה כי יותר מ-75% מהם מעורבים בתקשורת תאית ותהליכי רגולציה. המערכות הביולוגיות בהן מצוי היצוג הגבוה ביותר בקבוצת הגנים הזו היו האימונולוגית והעצבית^[26]. ממצא זה לא מצביע בהכרח על חשיבות השחבור החליפי במערכות אלו לעומת מערכות אחרות, אך יכול לרמוז על חשיבותו במערכות מורכבות בהן עיבוד המידע עשוי להשתנות בזמנים או כתגובה למצבים פיזיולוגיים שונים^[1].

שחבור חליפי לרוב עובר בקרה ספציפית כתלות בסוג התא בו הוא מתבצע או בשלב התפתחותי מסוים^[25]. במערכת העצבים ובתהליך המוות התאי המבוקר (אפופטוזה) הוכח כי ישנו תיאום של שינויים בדפוסי השחבור החליפי בין מולקולות pre-mRNA רבות המשתתפות באותם תהליכים^[27][28]. בחירת אתר השחבור צריכה להיות מבוקרת ברמת הזמן והמיקום בו מתרחש ההליך^[25]. זיהוי אתר השחבור משלב אינטראקציות רבות שתורמות בין היתר גם ליצירת קומפלקס חלבוני, המבצע את חיתוך ה-pre-mRNA, ונקרא ספלייסוזום^[29]. אתרי שחבור בצד '5 ובצד '3 של מולקולות ה-RNA, שמהווים את הגבול בין כל אקסון ואינטרון, מוגדרים על ידי רצף אחיד (קונצנזוס). רצפי הקונצנזוס שמורים במהלך האבולוציה (הבסיסים השמורים ביותר הם GU בקצה ה'5 ו-AG בקצה ה'3 של האינטרון). בין רצפי הקונצנזוס בקצוות האינטרון, מצוי רצף נוסף שנקרא 'רצף הסתעפות' (branch point), המכיל את הנוקלאוטיד אדנין (A). רצף זה מאפשר יצירת מבנה דמוי לולאה (lariat) שנוצר בעקבות אינטראקציות עם חלבונים קושרי RNA מהספלייסוזום, בין רצף הGU מהקצה ה'3 של האינטרון ל-A מהbranchpoint. הקצה ה'3 מתנתק מהאינטרון, נוצרת לולאה ואז מתרחש הניתוק של הקצה ה'5^[30][31].

מנגנון בחירת אתר השחבור בעת שחבור חליפי אינו ידוע לחלוטין. מחקרים רבים תומכים בכך שהבחירה נעשית בשילוב של מספר גורמים. אותות שחבור שונים, זיקת מרכיבי הספלייסוזום לרצף הקונצנזוס, אלמנטי ויסות (כגון מתילציה וזרחון), חלבונים קושרי RNA שונים והאינטראקציות ביניהם משפיעים על בחירת אתר חיתוך אחד על פני משנהו כתלות בתנאים פיזיולוגיים^[32][33]. ההסתברות לשחבור גבוהה יותר בהתאם ל'חוזק' של אתר השחבור והיחס בין כמות אתרי השחבור וכמות המולקולות קושרות ה-RNA (מולקולות RNA-binding) שעוברות איתו אינטראקציה, לדוגמה מולקולת U1 שמהווה חלק מהספלייסוזום. אתר שחבור מסווג כ"חזק" או "חלש" בהתאם לדמיון שלו למוטיב הקונצנזוס של השחבור^[34]. ישנם משתנים נוספים שיכולים להשפיע על ההסתברות לשחבור, ולגרום להעדפת שחבור באתר "חלש" יחסית. פקטורי RNA וחלבונים עלולים למסך על חוזקו של אתר מסוים ולהטות את ההסתברות לטובת שחבור באתר ה"חלש"^[34]. שלבי הרכבת הספלייסוזום וזיהוי אלמנטי הקונצנזוס בשני קצוות האינטרון הם בין המוקדים החשובים ביותר לבקרה על השחבור^[35]. גורם בקרתי חשוב נוסף הוא מתילציה על גבי רצף ה-DNA שמשפיעה על בחירת האקסון במנגנון השחבור ועל הבקרה של התהליך כולו. באקסונים להם יש שחבור חליפי אחוז ה-GC גבוה מאוד ביחס לאקסונים אחרים. נוצרים בהם יותר אתרי CpG עליהם מתרחשת מתילציה. אחד הגורמים הידועים לכך הוא חלבון קושר DNA שנקרא CTCF. כאשר אתר הקישור שלו על ה-DNA אינו ממותל, CTCF נקשר לפני האקסון החליפי ויוצר מחסום שלא מאפשר תעתוק מהיר וגורם לשעתוק האקסון החליפי. כאשר האתר ממותל נמנע הקישור של CTCF השעתוק מתבצע מהר יותר וישנו דילוג על האקסון החליפי^[36].

פגם בבקרה על תהליך השחבור מעורב בכ-15% מהמחלות הגנטיות^[37], המחלות נגרמות עקב מוטציה שהורסת אתר שחבור פונקציונלי או יוצרת אתר חיתוך חדש^[38]. לדוגמה, שחבור לא נכון של אקסון 18 בגן BRCA1(אנ') ידועה כאחד הגורמים להתפתחות סרטן השד והשחלות^[39].

שחבור דיפרנציאלי הוא מצב בו קיים שוני בטרנסקריפטים המתועתקים מאותו הגן או ביחס ביניהם במצבים שונים. השוני יכול להתבטא ברקמות שונות, שלבים התפתחותיים שונים, כתלות במין (מגדר), במצב בריאותי או בעקבות טיפול כלשהו^[40][41][42]. במינים שונים של Drosophila הוכח שיש שוני ברמת הביטוי של טרנסקריפטים שונים במגוון גנים ברקמות שונות, שלבים התפתחותיים שונים ובין מינים^[43]. שוני בריכוז של איזופורם (טרנסקריפט שעבר תרגום לחלבון) (אנ') אשר מתורגם לחלבון מסוים, יכול להשפיע רבות על התהליכים המושפעים מפעילות החלבון. דוגמה לכך מגיעה מניסויים שנערכו על הגן APP (אנ'). גן זה מבוטא בעיקר במוח וככל הנראה עוזר בכיוון הגירת תאי עצב. לגן לפחות שלושה איזופורמים מתועדים. במחלת האלצהיימר יש ירידה דרסטית בפעילות החלבון עמילואיד בטא שמתורגם מאחד האיזופורמים של APP (איזופורם APP₆₉₅). בניסוי שנערך בעכברים נראה, כי בעליה בריכוז תוצר שחבור חליפי אחר, על חשבון APP₆₉₅, גדל הסיכוי לפיתוח מחלות אלצהיימר^[44][45][46]. שינוי ביחסי טרנסקריפטים יכול להשפיע על תהליכים רבים בהם מוות תאי, חדירה לרקמות ויצירת גרורות בתהליך הסרטני^[47][48].