ב-1993 סיימה קורס לטייסי ניסוי של הצי ושירתה כטייסת ניסוי. ב-1995 מונתה למדריכה בקורס טייסי הניסוי של הצי. בהמשך הוצבה על סיפון אוניית הסער סאיפן כעוזרת קצין הטיסה של האונייה עד שהתקבלה ב-1998 לתוכנית האסטרונאוטים של נאס"א.
ויליאמס הגיעה לדרגת קפטן וצברה בסך הכל למעלה מ-3,000 שעות טיסה תוך הטסת למעלה מ-30 דגמי כלי טיס.
ב-15 ביולי2012 יצאה ויליאמס שוב למשימה בתחנת החלל הבינלאומית (משלחות 32 ו-33) על גבי רכב החלל סויוז (Soyuz TMA-05M) ששוגר מקוסמודרום בייקונור שברוסיה, אשר עגן בתחנת החלל יומיים לאחר מכן. ב-17 בספטמבר 2012, בתחילת משימה 33, הייתה ויליאמס למפקדת צוות התחנה – האשה השנייה ששימשה בתפקיד זה. ב-19 בנובמבר שבה לכדור הארץ על גבי סיפון רכב חלל רוסי, לאחר 127 ימים בחלל. במהלך שהות זו ערכה עוד שלוש משימות של פעילות חוץ-רכבית. כמו כן הייתה לאסטרונאוט הראשון שהשתתף בתחרות טריאתלון בחלל. היא השתמשה במסילת הכושר ואופני הכושר של התחנה ובמקום שחייה עשתה מאמץ שקול לכך באמצעות הרמת משקולות ותרגילי כוח.
במהלך משימותיה שהתה ויליאמס בחלל בסך הכל 319 ימים והשתתפה בשבע משימות פעילות חוץ-רכבית, שאורכן המצטבר היה 50 שעות ו-40 דקות. בכך הייתה לשיאנית הזמן בפעילות חוץ-רכבית לאסטרונאוטיות והחמישית במשך הזמן לפעילות חוץ-רכבית לאסטרונאוטים בכלל. שיא זה נשבר במרץ 2017 על ידי פגי ויטסון שביצעה את הליכת החלל השמינית שלה.[1]
ביולי 2015, נאס"א הכריזה כי ויליאמס תהיה חלק מצוות האסטרונאוטים שיתאמנו לטיסות המסחריות לאספקת תחנת החלל הבינלאומית במסגרת תוכנית 2 CCDev. ויליאמס, דאג הארלי, אריק בו ורוברט בנקן, כולם אסטרונאוטים עתירי ניסיון, נבחרו לעבוד ולהתאמן בצמוד עם אנשי חברות בואינג ו־SpaceX המתכננים את החלליות.[2]
ויליאמס עוטרה בעיטורים שונים, לרבות עיטורים מרוסיה, הודו וסלובניה.