Sonda de hibridación
En bioloxía molecular, unha sonda de hibridación é un fragmento de ADN ou ARN de lonxitude variable (xeralmente de 100 a 1000 bases de longo), que está marcada radioactivamente ou con moléculas fluorescentes. Pode utilizarse con mostras de ADN ou ARN para detectar a presenza de secuencias de nucleótidos (o ADN diana) que son complementarias coa secuencia da sonda. A sonda só se hibridsará cun ácido nucleico monocatenario (ADN ou ARN) cuxa secuencia de bases permita o apareamento de bases sonda-diana debido á complementariedade entre ambas. Primeiro desnaturalízase a sonda marcada (por quentamento ou baixo condicións alcalnas, como a exposición a hidróxido de sodio) para orixinar o ADN monocatenario da sonda e despois hibrídase co ADN monocatenario diana (por medio de Southern blot) ou co ARN (por northern blot) inmobilizado nunha membrana ou in situ por hibridación in situ fluorescente.
Para detectar a hibridación da sonda coa súa secuencia diana, a sonda é etiquetada cun marcador molecular radioactivo ou (máis recentemente) fluorescente. Os marcadores usados comunmente son o 32P (un isótopo radioactivo do fósforo incorporado no enlace fosfodiéster da sonda de ADN) ou a Digoxixenina, que non é radioactivo, senón un marcador baseado nun anticorpo. As secuencias de ADN ou transcritos de ARN que teñen unha semellanza de secuencia de moderada a alta coa sonda son despois detectados visualizando a sonda hibridada por autorradiografía ou outras técnicas de obtención de imaxes. Normalmente, ou se toman imaxes de raios X do filtro, ou o filtro sitúase baixo a luz UV. A detección de secuencias con semellanza alta ou moderada depende do rigorosas que sexan as condicións de hibridación que se apliquen. Unhas condicións moi severas, como unha temperatura de hibridación alta e baixo nivel de sales nos tampóns de hibridación, permiten soamente a hibridación entre secuencias de ácido nucleico que son moi similares, mentres que unhas condicións pouco severas, como unha temperatura baixa e un nivel alto de sal, permiten a hibridación cando as secuencias son menos similares. As sondas de hibridación usadas nas micromatrices de ADN consisten nun ADN unido covalentemente a unha superficie inerte, como láminas de vidro cubertas ou chips de xenes, ao cal se hibrida unha diana de ADNc móbil.
Dependendo do método, a sonda pode ser sintetizada usando o método da fosforamidita, ou pode xerarse e etiquetarse por amplificación por PCR ou clonación (ambos son métodos antigos). Para incrementar a estabilidade in vivo da sonda non se usa ARN, e no seu lugar poden usarse análogos do ARN, en particular derivados morfolino. As sondas baseadas en ARN ou ADN molecular son agora utilizadas rotinariamente en bibliotecas de xenes de screening, detectando secuencias de nucleótidos con métodos de blotting, e outras tecnoloxías de xenes, como micromatrices de ácidos nucleicos e tecidos.
Exemplos de sondas
- Sondas Scorpion®
- Sondas Molecular Beacon
- Sondas TaqMan®
- Sondas LNA® (Locked Nucleic Acid, de ácido nucleico bloqueado)
- Sondas CPT (Cycling probe technology, Tecnoloxía de sondas cicladoras).
Usos en ecoloxía microbiana
No campo da ecoloxía microbiana, as sondas de oligonucleótidos utilízanse para determinar a presenza de especies microbianas, xéneros ou microorganismos clasificados a nivel amplo, como bacterias, arqueas, e eucariotas por medio de hibridación in situ fluorescente (FISH).[1] As sondas de ARNr permitiron aos científicos visualizar os microorganismos, aínda por cultivar en instalacións de laboratorio, ao recoller mostras de secuencias de ARNr directamente do medio ambiente.[2] Exemplos deste tipo de microorganismos son:
- Nevskia ramosa: N. ramosa é unha bacteria do neusto que forma unhas típicas rosetas ramificadas dicotomicamene sobre a superficie de hábitats de auga doce de pouca profundidade.[3]
- Achromatium oxaliferum: Esta enorme bacteria (cunha lonxitude celular de >100 µm, e un diámetro de 50 µm) contén glóbulos de xofre e inclusións masivas de calcita e habita nas capas superiores de sedimentos de auga doce. É visible a simple vista e, debido á súa resistencia a ser cultivada, ten desconcertado a varias xeracións de microbiólogos.[4]
Limitacións
En certos casos, a difeenciación entre especies pode ser difícil de facer ao usar as secuencias de ARNr 16S debido á súa semellanza. Neses casos, unha mellor alternativa pode ser o ARNr 23S.[5] A biblioteca estándar global de secuencias de ARNr está crecendo e sendo actualizada continuamente, de modo que a posibilidade dun evento de hibridación aleatorio entre unha sonda deseñada especificamente (baseada nos datos completos e actuais dun conxunto de organismos que se queren probar) e un organismo diana non desexado/descoñecido non pode desbotarse facilmente.[6] Polo contrario, é perfectamente posible que existan microorganismos, aínda sen identificar, que sexan filoxeneticamente membros dun grupo diana da sonda, pero teñan sitios diana parciais ou case perfectos. Isto xeramente aplícase cando se deseñan sondas específicas de grupo.
Probablemente, a maior limitación práctica desta técnica é a falta de automatización.[1]
Uso en ciencias forenses
En ciencias forenses, as sondas de hibridación úsanse, por exemplo, para a detección de rexións con repeticións en tándem curtas (microsatélite) e en métodos para polimorfismos de lonxitude de fragmento de restrición (RFLP), todos os cales se usan moito para facer análises de perfil de ADN.