CRISPR
CRISPR eli clustered regularly-interspaced short palindromic repeats ovat DNA-jaksoja, jotka muodostavat useiden bakteerien ja arkkien alkeellisen immuunipuolustuksen arkki- ja bakteeriviruksia vastaan. Näihin jaksoihin ja Cas-proteiineihin (CRISPR associated protein) pohjautuvia geenimuuntelutekniikoita on kehitetty, esimerkiksi CRISPR/Cas9-menetelmä.[1]
CRISPR-systeemejä on useita, mutta kukin koostuu mm. nukleaaseina (DNA:ta pilkkovina proteiineina) toimivia Cas-proteiineja koodaavasta cas-sekvenssistä ja "muistina" toimivasta CRISPR-sekvenssistä, jota käytetään bakteerivirusten eli bakteriofagien vieraan perimän tunnistukseen ja tallettamiseen. Cas1 ja Cas2 ovat kaikissa luonnosta löydetyissä systeemeissä läsnä.[2]
CRISPR-termi on englanninkielinen lyhenne. Infektion tunnistavat sekvenssit ovat bakteerin (tai arkin) DNA:ssa ryppäytyneesti tasaisin välimatkoin toisistaan (CRI). Bakteerit ottavat tunnistussekvensseihin vain osan viruksen perimästä. Tunnistussekvenssit erottavat toisistaan lyhyet palindromiset toistosekvenssit (SPR)[2], jotka eivät ole peräisin viruksen genomista.
CRISPR-Cas9 geenin muokkaustekniikka oli merkittävässä asemassa Emmanuelle Charpentierille ja Jennifer Doudnalle vuonna 2020 myönnetyssä Nobelin kemianpalkinnosta
Toiminta luonnossa
Aiemmin kohdatun viruksen tunnistus[3]
1. Kun bakteeriin (tai arkkiin) tuodaan viruksen DNA:ta, jolle bakteeri on jo immuuni, tuottaa bakteeri Cas-proteiinin ja CRISPR-sekvenssin alueelta aiemmin talletetun crRNA:n (CRISPR RNA). crRNA sisältää sekvenssin, joka on komplementaarinen eli emäksiltään yhteen sopiva lyhyeen sekvenssiin viruksen DNA:ssa.
2. Cas ja crRNA muodostavat kompleksin.
3. Kompleksi sitoo viruksen DNA:n crRNA:n komplementaarisen sekvenssin avulla.
4. Cas pilkkoo viruksen DNA:n toimimattomaksi ja estää siten viruksen monistumisen ja bakteerin infektoitumisen.
Uuden viruksen tunnistus[3]
1. Kun bakteeriin (tai arkkiin) tuodaan viruksen DNA:ta, jolle bakteeri ei ole immuuni, bakteeri tuottaa Cas1-nukleaasin.
2. Cas1 sitoo jonkin sekvenssin viruksen DNA:sta ja pilkkoo sen sopivan pituiseksi pätkäksi.
3. Pätkä liitetään CRISPR-alueeseen bakteerin DNA:han pysyvästi. Tällöin bakteeri "muistaa" infektion ja voi puolustautua sitä vastaan.
Käyttö geenimuuntelussa
Esimerkiksi CRISPR/Cas9-systeemi on geenimuuntelutekniikka, johon sisältyy yksinkertaisimmillaan vain Cas9-proteiini, Cas9:n ohjaukseen käytetty RNA-pätkä ja muuntelun kohteena oleva DNA. Tekniikka toimii elävissä soluissa. Muunteluun osallistuvat komponentit voidaan pistää soluun sisälle mikroskooppisen ohuella injektioneulalla.[4]
Tekniikassa luonnossa normaalisti erillään olevista tracrRNA:sta (trans-activating crRNA) ja crRNA:sta on tuotettu kimeeri, yhtenäinen RNA-ohjausjakso. Kimeeriä kutsutaan sgRNA:ksi (single guide RNA) ja se muodostetaan, jotta muuntelussa on vähemmän osallistuvia RNA:ita (kahden sijaan yksi). sgRNA voidaan tuottaa synteettisesti.[4]
Luonnossa tracrRNA:n tehtävänä on pitää crRNA:ta paikallaan Cas9:ssä crRNA:n kanssa komplementaarisen sekvenssinsä kanssa. crRNA:ssa puolestaan on normaalisti viruksen tunnistukseen käytetty sekvenssi, mutta sekvenssi on korvattu sgRNA:ssa muuntelun kohteena olevan DNA:n tietyn alueen kanssa komplementaariseksi.[4]
Cas9-nukleaasi ohjautuu sgRNA:ssa olevan RNA-sekvenssin avulla tiettyyn kohtaan DNA:ssa, tämän kanssa komplementaariseen sekvenssiin. Oikeassa kohdassa ollessaan Cas9 leikkaa DNA:n tietystä kohtaa. Tätä voidaan käyttää ns. knock-out muunteluun, jossa tarkastellaan geenien poiston eli inaktivaation vaikutusta soluun tai suurempaankin eliöön. Solu pyrkii korjaamaan katkoksen ja liittämään DNA-pätkät yhteen. Vaihtoehtoisesti katkokseen voidaan useimmiten liittää eli insertoida halutunlainen geeni.[4]
CRISPR/Cas9-menetelmässä täytyy periaatteessa vain ensin selvittää geenimuuntelun kohteena olevan DNA:n sekvenssi sekvensoimalla.
Moniin muihin geenimuuntelutekniikoihin verrattuna CRISPR/cas9 on äärimmäisen tarkka, laajalti sovellettavissa, halpa ja yksinkertainen käyttää. Tekniikka on 2010-luvusta lähtien mullistanut geenimuuntelua ja geenitutkimusta suuresti:[5][6] se esimerkiksi teki geeniajureiden käytön mahdolliseksi.[7]
Lähteet
Aiheesta muualla
