PAH (gen)

Smatra se da se reakcija odvija u sljedećim koracima:

1. formiranje mosta Fe (II)-O-O-BH₄.
2. heterolitičko cijepanje O-O veze, kako bi se dobio feril-okso hidroksilacijski međuprodukt Fe (IV) = O
3. napad na Fe(IV)=O da hidroksilira fenilalaninski supstrat u tirozin.^[7]

Formiranje i rascjep gvožđe-peroksipterinskog mosta: Iako dokazi snažno podržavaju da je Fe(IV)=O hidroksilirajući intermedijar,^[8] mehanički detalji koji su u osnovi formiranja mosta Fe(II)-O-O-BH₄ prije heterolitnog cijepanja i dalje su kontroverzni. Predložena su dva puta na osnovu modela koji se razlikuju po blizini gvožđa do kofaktora pterina i broju molekula vode za koje se pretpostavlja da su tokom katalize koordinirane gvožđem. Prema jednom modelu, kompleks gvožđe-dioksida je inicijalno formiran i stabiliziran kao rezonantni hibrid Fe²⁺O₂ i Fe³⁺O₂^– . Aktivirani O₂ zatim napada BH₄, tvoreći prijelazno stanje koje karakterizira razdvajanje naboja između pterinskog prstena s nedostatkom elektrona i elektronom bogatih vrsta kisika.^[9] Kasnije se formira most Fe(II)-O-O-BH₄. S druge strane, formiranje ovog mosta modelirano je pretpostavljajući da se BH4 nalazi u prvoj koordinacijskoj ljusci gvožđa i da ono nije koordinirano ni s jednom molekulom vode. Ovaj model predviđa drugačiji mehanizam, koji uključuje radikal pterina i superoksid, kao kritične međuprodukte.^[10] Kad se formira, Fe(II)-O-O-BH₄, most se razgrađuje putem heterolitskog cijepanja O-O veze na Fe(IV)=O i 4a-hidroksitetrahidrobiopterin; stoga je molekulski kisik izvor oba atoma kisika koji se koriste za hidroksilaciju pterinskog prstena i fenilalanina.

Hidroksilacija fenilalanina pomoću feril-okso međuproizvoda: Budući da mehanizam uključuje Fe(IV)=O (za razliku od peroksipterina) hidroksilacijski intermedijer, oksidacija kofaktora BH₄ i hidroksilacija fenilalanina može se odvojiti, što rezultira neproduktivnom potrošnjom BH₄ i stvaranjem H₂O₂.^[7] Međutim, kada je produktivan, Fe(IV)=O međuprodukt dodaje se fenilalaninu u reakciji elektrofilne aromatske supstitucije koja reducira gvožđe iz feri u stanje fero.^[7] Iako je u početku bio predložen arenski oksid ili radikalni međuprodukt, analize srodnih triptofan– i tirozin-hidroksilaze sugerirale su da se reakcija umjesto toga odvija kroz kationski intermedijer koji zahtijeva da se Fe(IV)=O koordinira s vodenim ligandom, a ne s hidrokso-grupom.^[7][11] Ovaj kationski intermedijer naknadno prolazi 1,2-hidridni NIH pomak, dajući dienonski međuprodukt koji se zatim tautomerizira u tvorbu tirozinskih proizvoda.^[12] Kofaktor pterina regenerira se hidratacijom karbinolaminskog produkta PAH u kinonoid-dihidrobiopterin (qBH₂), koji se zatim reducira na BH₄.^[13]

Predlaže se da se PAH koristi morfinski model alosterne regulacije.^[14][15]

Sisarski PAH postoji u ravnoteži koja se sastoji od tetramera dvije različite arhitekture, s jednim ili više dimernih oblika kao dijelom ravnoteže. Ovo ponašanje je u skladu s disocijativnim alosternim mehanizmom.^[15]

Mnoge studije sugeriraju se sisarski PAH ponaša usporedivo s porfobilinogen-sintazom (PBGS), pri čemu se navodi da različiti faktori, poput pH i vezivanja liganda, utiču na aktivnost enzima i stabilnost proteina.^[15]

Dužina polipeptidnog lanca je 452 aminokiseline, a molekulska težina 51 862Da.^[16]

Simboli

Monomer PAH (51,9 kDa) sastoji se od tri različita domena: regulatornog N-terminalnog (ostaci 1–117) koji sadrži Phe-vezujuću ACT poddomeni, katalitskog domena (ostaci 118-427) i domena C-terminala (ostaci 428–453), odgovornih za oligomerizaciju identičnih monomera. Provedena je opsežna kristalografska analiza, posebno na katalitskom domenu koordiniranom pterinom i gvožđem, kako bi se ispitalo aktivno mjesto. Određena je i struktura N-terminalnog regulatornog domena, a zajedno s riješenom strukturom homolognog C-terminalnog domena tetramerizacije tirozin-hidroksilaze, a predložen je i strukturni model tetramernog PAH-a.^[13] Using X-ray crystallography, the structure of full-length rat PAH was determined experimentally and showed the auto-inhibited, or resting-state form of the enzyme.^[17] Oblik stanja mirovanja (RS-PAH) arhitektonski se razlikuje od aktiviranog oblika (A-PAH).^[18] Još uvijek nedostaje cjelovita struktura A-PAH-a, ali je utvrđeno Phe stabilizirano sučelje ACT-ACT, koje je karakteristično za A-PAH i predložen je strukturni model A-PAH na osnovu analize SAXS-a.^[19][20]

Riješene kristalne strukture katalitskog domena ukazuju na to da se aktivno mjesto sastoji od otvorenog i prostranog džepa obloženog prvenstveno hidrofobnim ostacima, iako su prisutna i tri ostatka glutaminske kiseline, dva histidina i tirozin koji vežu gvožđe.^[13] Postoje kontradiktorni dokazi o koordinacijskom stanju gvožđevog atoma i njegovoj blizini BH₄ unutar aktivnog mjesta. Prema kristalografskoj analizi, Fe(II) je koordiniran vodom, His285, His290 i Glu330 (aranžman trijade 2-his-1-karboksilatoliki) sa oktaedarskom geometrijom.^[21] Uključivanjem analoga Phe u kristalnu strukturu, mijenja se i gvožđe iz šesto– do petokoordiniranog stanja koje uključuje jednu molekulu vode i dvozubu koordinaciju do Glu330 i otvaranje mjesta za vezanje kisika. BH₄ se istodobno pomiče prema atomu gvožđa, iako pterinski kofaktor ostaje u drugoj koordinacijskoj sferi.^[22] S druge strane, konkurentski model zasnovan na NMR i analizama molekulskog modeliranja sugerira da su sve koordinirane molekule vode prisiljene napustiti aktivno mjesto tokom katalitskog ciklusa, dok BH₄ postaje izravno koordiniran gvožđem.^[23] Kao što je gore navedno, rješavanje ove razlike bit će važno za utvrđivanje tačnog mehanizma PAH katalize.

Regulatorna priroda N-terminalnog domena (ostaci 1–117) data je njegovom strukturnom fleksibilnošću.^[24] Analiza izmjene vodik/deuterij pokazuje da alosterno vezivanje Phe globalno mijenja konformaciju PAH, tako da je aktivno mjesto manje zagueno, jer je sučelje između regulatornih i katalitskih domena sve izloženije rastvaraču.^[24][25][26] Ovo zapažanje je u skladu s kinetičkim studijama, koje pokazuju početno nisku stopu stvaranja tirozina za PAH cijele dužine. Ovo vrijeme kašnjenja se ne primjećuje za krnji PAH bez N-terminalnog domena ili ako je enzim pune dužine prethodno inkubiran s Phe.

Delecija domena N-terminala također eliminira vrijeme kašnjenja i povećava afinitet za Phe gotovo dvostruko; ne primjećuje se razlika u V_max ili K_m za kofaktor tetrahidrobiopterina.^[27] Dodatne propise pruža Ser16; fosforilacija ovog ostatka ne mijenja konformaciju enzima, ali smanjuje koncentraciju Phe potrebnu za alosteričku aktivaciju.^[26] Ovaj N-terminalni regulatorni domen nije primijećena u bakterijskih PAH-a, ali pokazuje značajnu strukturnu homologiju sa regulatornim domenom fosfogilcerat-dehidrogenaza, enzima u biosintetskom putu serina.^[26]

Prokariotski PAH je monomerni, dok eukariotski postoji u ravnoteži između homotetramernih i homodimernih oblika.^[7][13] Interfejs dimerizacije sastoji se od petlji povezanih sa simetrijom koje povezuju identične monomere, dok se preklapajući C-terminalni domen tetramerizacije posreduje u udruživanju konformacijski različitih dimera, koje karakterizira različita relativna orijentacija katalitskog i tetramerizacijskog domena (Flatmark, Erlandsen). Rezultirajuće izobličenje simetrije tetramera očito je u diferencijalnoj površini sučelja dimerizacije i razlikuje PAH od tetramerno simetrične tirozin-hidroksilaze.^[13] Predložen je mehanizam zamjene tetramernog domena iz dimernog, u kojima alfa-heliksi C-terminala međusobno mijenjaju svoju konformaciju oko fleksibilnog područja šarki sa pet ostataka sa C-terminalom, kako bi formirale strukturu uprede zavojnice, pomičući ravnotežu prema tetramernom obliku.^[7][13][28] Iako su i homodimerni i homotetramerni oblici PAH katalitski aktivni, ova dva pokazuju različitu kinetiku i regulaciju. Osim smanjene katalitske učinkovitosti, dimer ne pokazuje pozitivnu kooperativnost prema L-Phe (koji pri visokim koncentracijama aktivira enzim), što sugerira da L-Phe alosterno regulira PAH, utičući na interakciju dimer-dimer.^[28]

PAH je kritični enzim u metabolizmu fenilalanina i katalizira korak ograničavanja brzine u njegovom potpunom katabolizmu do ugljik-dioksida i vode.^[13][29] Regulacija protoka kroz puteve povezane s fenilalaninom kritična je u metabolizmu sisara, što dokazuje toksičnost visokih koncentracija ove aminokiseline u plazmi zabilježena u fenilketonuriji (vidi dolje). Glavni izvor fenilalanina su uneseni proteini, ali relativno malo ovog bazena koristi se za sintezu proteina.^[29] Umjesto toga, većina unesenog fenilalanina se katabolizira kroz PAH u oblik tirozin; dodavanje hidroksilne grupe omogućava da se benzenski prsten razbije u narednim katabolitskim koracima. Transaminacija u fenilpiruvat, čiji se metaboliti izlučuju urinom, predstavlja još jedan put prometa fenilalanina, ali prevladava katabolizam putem PAH-s.^[29]

Kod ljudi, ovaj enzim se eksprimira i u jetri i u bubrezima, a postoje neke indicije da se u tim tkivima može različito regulirati.^[30] PAH je neobičan među hidroksilazama aromatskih aminokiselina po svom učešću u katabolizmu; tirozin i triptofan-hidroksilaza , s druge strane, primarno se eksprimiraju u centralnom nervnom sistemu i katalizuju korake koji ograničavaju brzinu u biosintezi neurotransmitera/hormona.^[13]

Nedostatak aktivnosti PAH-a zbog mutacija u PAH-u uzrokuje hiperfenilalaninemiju (HPA), a kada se razina fenilalanina u krvi poveća iznad 20 puta normalne koncentracije, dolazi do metaboličke bolesti fenilketonurija (PKU).^[29] PKU je i genotipski i fenotipski heterogen: identificirano je preko 300 različitih patogenih varijanti, od kojih većina odgovara misens mutacijama koje se preslikavaju u katalitski domen.^[13][21] Kada je kohorta identificiranih mutanata PAH eksprimirana u rekombinantnim sistemima, enzimi su pokazali promijenjeno kinetičko ponašanje i/ili smanjenu stabilnost, u skladu sa strukturnim mapiranjem ovih mutacija i na katalitski i na tetramerizacijski domen enzima.^[13] BH4 ₄ primijenjen je kao farmakološki tretman i pokazano je da smanjuje razinu fenilalanina u krvi za segment pacijenata s PKU-om, čiji su genotipovi dovode do neke zaostale aktivnosti PAH -a, ali nemaju nedostatak u sintezi ili regeneraciji BH4₄. Kontrolne studije ukazuju na to da u slučaju određenih PAH mutanata, višak BH4₄ djeluje kao farmakološki šaperon za stabilizaciju mutiranih enzima s poremećenim sastavom tetramera i povećanom osjetljivošću na proteolitsko cijepanje i agregaciju.^[31] Mutacije koje su identifikovane u lokusu PAH dokumentovane su u bazi poznatih fenilalanin hidroksilaze (PAHdb), [1].

Budući da fenilketonurija može uzrokovati nepovratna oštećenja, imperativ je da se nedostaci u fenilalanin-hidroksilazi utvrde u ranom razvoju. U početku je to učinjeno pomoću testa inhibicije bakterija poznatog kao Guthriejev test. Sada je PKU dio skrininga novorođenčadi u mnogim zemljama, a povišene razine fenilalanina se identificiraju ubrzo nakon rođenja mjerenjem tandemskom masenom spektrometrijom. Stavljanjem osoba na dijetu sa niskim sadržajem fenilalanina, visokim tirozina, može se spriječiti dugotrajno oštećenje njihovog razvoja.

Fenilalanin-hidroksilaza je usko povezana sa dva druga enzima:

• triptofan-hidroksilaza (EC broj 1.14.16.4), koji kontrolira nivo serotonina u mozgu i gastrointestinalnom traktu
• tirozin-hidroksilaza (EC broj 1.14.16.2), koji kontrolira nivoe dopamina, epinefrina i norepinefrina u mozgu i srži nabubrežnih žlijezda.

Tri enzima su homologna, odnosno smatra se da su nastala iz iste iste drevne hidroksilaze.

• GeneReviews/NCBI/NIH/UW entry on Phenylalanine Hydroxylase Deficiency
• Locus-specific database of the human phenylalanine hydroxylase gene variants
• Molecule of the Month: Phenylalanine Hydroxylase Arhivirano 16. 10. 2015. na Wayback Machine
• P00439

Šablon:Modulatori metabolizma monoamina

Portal Biologija